引　言

　　竹材是一种重要的生物材料。与木材相比，不仅在宏观形态上有巨大差别，而且在微观结构上也表现出明显的不同。竹材细胞与木材细胞一样，都具有分层结构，但是竹材细胞的分层结构更为明显而多变。壁层数量在不同竹种、不同部位有较大变异，层数最少的２～３层，最多可达１８层。由于竹子具有特殊的结构，并具有生长迅速、强度高、柔韧性好、用途广泛等诸多优点，学者们很早就对竹材细胞壁产生了浓厚兴趣，化学物质分布就是其中一项重要的研究内容。

    竹材细胞壁化学成分分布研究以木质素分布为主，经历了从组织水平到细胞水平的发展过程。目前对不同发育阶段木质素在不同细胞组织中的沉积顺序已经有了清楚的认识，但对单一细胞中木质素沉积及其分布规律的认识仍不够深入。竹材细胞壁是由数层厚薄不同的壁层依次交替构成。这些壁层的厚度通常较小，有的在１００ｎｍ 以下，给壁层化学物质分布研究带来了很大困难。传统的光谱分析法如紫外分光光度计，可见光分光光度计，拉曼光谱等，由于光学衍射极限的限制，很难揭示化学物质在这些具有纳米尺度的壁层内的分布情况。电子显微镜具有很高的空间分辨率，但通常需要进行化学染色或者借助其他标记方法如抗体标记等才能进行观察，制样复杂，操作难度大，并且易引入外部干扰因素，不能获得原位化学分布信息。

    纳米红外技术是近几年出现的一种化学分析手段。它将原子力显微镜和红外光谱仪整合成为一个系统，利用原子力探针探测红外吸收效应所产生的热膨胀，建立红外波长与热膨胀的函数关系，从而突破了传统红外衍射极限的限制，能获取纳米级的化学物质原位分布信息。该技术最早由法国ＰａｒｉｓＳｕｄ大学ＡｌｅｘａｎｄｒｅＤａｚｚｉ博士领导的科研团队开发和应用，现已在生命科学和材料科学中大量应用，尚未发现应用于植物细胞壁的研究。因此，本研究的目的是探讨应用纳米红外技术研究竹材细胞壁化学物质分布的可行性，为下一步的研究工作摸索实验技术。

1　实验部分

1.1　材料

所用试验材料为６年生毛竹，采自安徽黄山林场。选择生长正常的植株，自露出地面第一节开始计数，伐倒后于第十节间中部截取厚约５ｃｍ 的竹环，保鲜膜密封，干冰储存带回实验室后置于冰柜中冷冻，保存待用。

1.2　方法

1.2.1　纳米红外原理及测试方法

    本测试应用瑞宇科技的NanoIR测试系统。该系统采用侧面入射光模式，脉冲激光可调范围为９００～２０００和２２３５～３６００ｃｍ－１，光谱分辨率为４ｃｍ－１，空间分辨率为２０～１００ｎｍ。试样截取自竹壁中部，加工成１ｃｍ×１ｃｍ×５ｃｍ的小竹块，端部制成金字塔形，并使纤维束位于金字塔尖端。经干燥处理后，利用钻石刀在超薄切片机上对金字塔尖的纤维束进行表面抛光，获得一个平整的表面，然后进行纳米红外测试。

1.2.2　显微红外测试

    取竹壁中部的竹材，加工成１ｃｍ×１ｃｍ×５ｃｍ的小竹块，用钨钢刀在滑走切片上切取包含一个完整维管束，厚度为５μｍ 的竹材横切面切片，置于两载玻片之间自然气干，再置于６０ ℃烘箱内干燥１５ ｍｉｎ后，进行显微红外测试。测试采用傅立叶变换显微红外光谱仪，将大小为２０μｍ×２０μｍ 的红外光斑聚焦到竹材纤维细胞上，在透射模式下采集细胞壁的红外吸收谱，扫描次数１００次。

1.2.3　拉曼光谱测试

    取竹壁中部的竹材，加工成１ｃｍ×１ｃｍ×５ｃｍ的小竹块，用钨钢刀在滑走切片上切取包含一个完整维管束，厚度为１０μｍ 的竹材横切面切片，展平于载玻片中央，蒸馏水封片后立即进行拉曼光谱测试。为防止测试过程中水分丧失而对测试产生不利影响，盖玻片四周采取树脂涂布固封处理。

    采用共焦显微拉曼光谱仪进行光谱采集和扫描成像。激发光为５３２ｎｍ 可见光，物镜采用１００倍油镜（ＮＡ＝１．４）。扫描成像试验参数设置为采谱曝光时间０．６６ｓ，扫描步距０．３３μｍ。木质素分布以苯环的伸缩振动峰（１５９８ｃｍ－１）进行成像。纤维素分布以纤维素分子链ＣＨ 伸缩振动峰（２８９３ｃｍ－１）进行成像。

2　结果与讨论

2.1　纳米红外光谱与显微红外光谱对比

    根据参考文献，纳米红外光谱与传统ＦＴＩＲ 红外光谱具有很高的吻合度。但这些多是基于无机物或组成相对简单有机物所获得的结果。竹材细胞壁为多组分构成的复杂有机体，情况可能会有所差别。为了验证纳米红外的可靠性，我们首先将其与传统红外技术进行对比。图２和图３分别为竹纤维的显微红外光谱和纳米红外光谱。红外主要谱峰归属列于表１。从图形对比来看，显微红外和纳米红外所获得的谱图存在明显的差别，主要表现为显微红外在１０００～１１００ｃｍ－１波数范围内的吸收强度显著强于其他波数范围内的吸收强度。而纳米红外在１７００～１７５０ｃｍ－１波数范围具有强烈吸收，在１０００～１１００ｃｍ－１波数范围内的吸收强度则明显降低。

    纳米红外是依靠原子力探针探测热膨胀来获得测试区域的化学信息。谱峰的吸收强度与基团的浓度及振动能级有关。基团的振动能级越高，数量越多，其吸收强度就越大。基团的振动能级与原子折合质量及化学键力常数有关，力学常数越大，折合质量越小，则振动能级就越大。常见基团的折合质量和化学键力学常数列于表２。１０００～１１００ｃｍ－１波数范围是Ｃ—Ｏ 基团的特征红外振动谱带，１７００～１７５０ｃｍ－１波数范围是ＣＯ 基团的特征红外振动谱带。两基团的折合质量相同，但ＣＯ 的力学常数为Ｃ—Ｏ 的两倍多，因此从振动能级来看，纳米红外中ＣＯ 的吸收强度要大于Ｃ—Ｏ 的吸收强度。从基团的浓度方面考虑，纳米红外采集的区域仅局限于针尖范围，采样面积小，而显微红外的采样范围数千倍于纳米红外，采样范围大，因此浓度差异对吸收强度的影响显微红外要比纳米红外小。基于以上两个方面的原因，就出现了两技术在上述波数范围内吸收强度的差异。但从谱峰位置来看，两者主要谱峰位置基本重合，说明纳米红外技术能反映竹材细胞壁的基本化学信息。

2.2  纳米红外成像

    由于纳米红外光谱与传统显微红外光谱所反映的基团振动信息相同，因此，我们可以选择特定的谱峰来研究化学物质在细胞壁中的分布。１５０４ｃｍ－１为木质素苯环的红外伸缩振动峰，１７３２ｃｍ－１ 为碳水化合物的红外伸缩振动峰，主要来源于半纤维素中木聚糖的伸缩振动，可以选择这两个红外谱峰进行扫描成像，分别代表木质素和木聚糖在细胞壁中的分布，成像结果见图４。图４（ａ）为原子力形貌图，清晰显示被测细胞的形貌特征，为一两层结构的细胞，内层宽度较大，细胞腔较小。图４（ｂ）和图４（ｃ）分别为该细胞木质素和木聚糖的分布情况，颜色越红表示红外吸收强度越大，也反映被测物质的分布浓度越大。从图４（ｂ）中可以看出，木质素在细胞角隅和复合胞间层的浓度较高，进入次生壁后浓度减小，但在次生壁内层中的浓度变化不大。木聚糖的分布与木质素的分布规律相似，但在细胞角隅和复合胞间层与次生壁内层的浓度差异更明显［图４（ｃ）］。

　　拉曼光谱技术是一项发展较为成熟的技术，已广泛用于植物细胞壁的化学成分分布研究。为了与纳米红外的成像效果作对比，我们也采用拉曼光谱对竹材纤维细胞进行了成像，结果见图５。图５（ａ）为测试细胞的形貌图，细胞的层次结构不如原子力形貌图清晰，但可以看出明显具有一个宽度很大的壁层。图５（ｂ）为木质素分布图，成像谱峰选择为木质素苯环的拉曼特征峰１５９８ｃｍ－１。木聚糖的拉曼谱峰与纤维素相重叠而无法区分，无法通过拉曼光谱来研究木聚糖在纤维细胞中的分布。我们对纤维素进行了拉曼成像。２８９３ｃｍ－１ 为ＣＨ 的拉曼伸缩振动峰，主要来源于纤维素，其在竹材细胞中的分布情况见图５（ｃ）。从拉曼分布图来看，木质素也是集中分布在细胞角隅和复合胞间层，进入次生壁后浓度减小［见图５（ｂ）］。宽层内的木质素浓度除靠近复合丙间层的区域有明显变化外，其他部位变化不大。值得注意的是，靠近细胞腔周围，有两圈木质素分布较为集中的窄层，木质素浓度较与其邻近的宽层大。结合形貌图来看，在靠近细胞腔时应该还有两层宽度较小的壁层。纤维素集中分布在次生壁内，并且较均匀，在细胞角隅和复合胞间层分布较少［见图５（ｃ）］。

　　对比纳米红外和拉曼光谱的成像，两者所反映的木质素的分布规律是一致的，即从细胞角隅向细胞腔方向，木质素浓度呈减小的趋势。但是两者的分辨率存在一定差别，相比来说纳米红外的空间分辨率更高，能达到纳米级。拉曼光谱成像在本实验的条件下，采用５３２ｎｍ 激光为激发光源，１００倍油镜（ＮＡ＝１．４），理论的空间分辨率为０．２３μｍ（０．６１λ／ＮＡ），设置的扫描步长为０．３３μｍ，因此实际的空间分辨率应大于３００ｎｍ。而纳米红外根据针尖尺寸和扫描步长确定，其分辨率小于２００ｎｍ，因此在分布图上可以发现木质素和木聚糖呈现团聚状不均匀的分布。

2.3　不同壁层的红外光谱

    纳米红外的一大优势之一就是它可以同时获得测试样品表面的形貌结构和化学信息。利用原子力显微镜获得清晰的形貌图之后，根据需要，可以将探针精确定位到感兴趣的微小区域进行纳米红外光谱采集。图６为竹材纤维细胞多壁层结构的纳米红外光谱原位采集试验。图６（ａ）为被测细胞的原子力形貌图，粗看大约为５层结构，其中宽度较大的两个壁层特别易于辨认。图６（ｂ）为图６（ａ）中红色矩形所示区域的局部放大图。通过放大图可以将在低倍下不能观察到的壁层清晰地显现出来。这些宽度不等的壁层相互结合在一起构成了竹材细胞特殊的多壁层结构。我们将纳米红外光谱的采集点设置在两层之间的交界处，如图６（ｂ）中的彩色矩形点所示，以研究这些壁层之间的化学性质变化。图６（ｃ）为被测细胞的形貌示意图，它实际为一六层结构的细胞。图６（ｄ）为不同壁层的纳米红外光谱。从谱图的变化来看，大致可以分为三个不同的类别。其中细胞角隅（ＣＣ）的光谱较为简单，谱峰较少，成为一类。第１～５层（Ｌ１～Ｌ５）谱形大致相似，可看作同一类别。相比ＣＣ 的光谱而言，在１３００～１５００ｃｍ－１波数范围出现了更多的峰，表明Ｌ１～Ｌ５ 层内的物质组成比ＣＣ复杂。第６ 层（Ｌ６）的红外光谱谱峰也较少，但峰特别明显，自成一类。通过不同壁层的光谱变化可以反映，在竹材的多层结构中，细胞角隅及最靠近细胞腔的壁层与其他各层之间的化学组成是不相同的，这可能与细胞角隅及细胞腔在竹材生长过程中所担当的功能与其他壁层不同有关，说明细胞壁的化学物质是根据植物的生长需要而有规律的沉积。

3　结　论

　　竹材细胞壁纳米红外光谱与传统显微红外光谱在９００～１０００ｃｍ－１波数和１６００～１７００ｃｍ－１波数范围内存在明显的谱峰吸收强度差别，但两者的谱峰位置基本相同，表明纳米红外光谱能正确地反映细胞壁的化学信息。

    纳米红外成像所揭示的木质素分布规律与拉曼成像所反映的规律一致，但具有更高的空间分辨率，能观察到木质素在细胞壁中具有团聚状的不均匀分布。

    纳米红外能获得清晰的样品形貌，并能对目标区域进行精确定位和光谱采集，获得纳米级的红外光谱，很适合用于具有纳米尺度的细胞壁层的化学物质组成和分布研究。